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PacBio Sequel

核心技术

    SMRT测序 PacBio Sequel是PacBio公司继RS、RSII系统后推出市面的第三款测序系统,核心技术是Single molecule Real-Time(SMRT)测序,即单分子实时测序,就是能够实现单个DNA分子的测序,并且实时监控测序结果。

Sequel测序系统特点

(1) 测序通量增加7倍

      Sequel系统在SMRT Cell性能方面进行了升级,将一个Cell的密度由原来的15万个ZMW孔增加到100万个,换言之,一个SMRT Cell的数据产出提高了约7倍,而且在该系统推出之初平均读长就已经达到8~12kb,使得测序达到更高通量。随着不断的技术改良,一个SMRT Cell的容量还将继续提升至400~800万个ZMW孔,甚至更多。

2) 测序成本显著降低

      Sequel测序系统缩减了光学系统,将仪器机身大小改良为原来的1/3,相对于Illumina Hiseq的体积也小11%。但是增大了SMRT Cell运作空间。根据官方给出的数据,一台Sequel售价35万美元,为RSII仪器售价的一半,而在测序通量上7倍的提升更是进一步降低了测序的成本,采用目前的P6-C4试剂,平均每个SMRT Cell可产生5-10Gb的数据,按每个Gb的数据产出成本显著降低。因此新型的Sequel测序系统非常适合进行大规模的研究,结合设立在武汉东湖综合保税区的菲沙基因PACBIO测序中心,将为广大研究人员提供更多的便利。

(3)项目周期更短

       Sequel测序系统每次运行都可装载1~16个SMRT Cell,样本制备仅需6小时,测序时间则为0.5~6小时,从样本制备到测序仅需1天时间就可以完成,并且可以根据实验设计具体要求进行调整。例如3G的人类基因组,进行50×测序,利用RSII需要约150个Cell,大概要运行10轮,而现在则仅需约15个Cell运行1~2轮可以完成,大大缩短了测序工作周期。

 

应用领域
1. 全基因组de novo测序
       与二代测序最高不超过1Kb的读长相比,PacBio Sequel的长读长将有效解决短序列数据的拼接难题。同时,与二代测序的模板样品需 要扩增相比,PacBio Sequel无需扩增可直接对单个分子进行测序,有效避免了PCR扩增偏好性和GC偏好性,PacBio Sequel可轻松 跨越GC含量异常(过高或过低)及高度序列重复的区域,实现序列覆盖的完整性和均一性。
2. 基因组草图的优化或基因组完成图绘制

      对前期已开展测序的动植物、微生物等基因组结合三代长读长测序数据进行完善和提升。针对前期已经开展全基因组测序,获得基因组 草图的动植物、微生物等,可以结合PacBio Sequel平台长读长reads进行补充,从而快速获得前期没有测得的信息及提升基因组的完 整度。另外还可以针对前期没有检测获得的结构变异信息(structural-variation events)、串联重复序列信息(tandem duplication)、易位信息(Inversion)等。尤其在微生物基因组完成图的绘制中,可在一天之内将基因组完善获得0 gap contig。
3. 全长转录本测序

       PacBio Sequel  的长读长可实现全长转录本测序,并使基因可变剪接形式的识别成为可能,因此可以对新基因及其isoform进行更全面 的研究。同时,长读长不再需要对RNA-Seq的reads进行组装,因此可以更完整的对基因模型和转录的基因进行更全面的注释,用以改 进参考基因组中的基因注释信息。
4.  宏基因组测序

      长读长reads能够更为精准地鉴定水体、土壤、肠道等生境中微生物的种类的鉴定,能够更加快捷地获得更多微生物物种的全基因组序列。
5. 16S rDNA全长测序
      PacBio Sequel的平均读长为8-12Kb,而16S rDNA长度大约为1540bp,因此结合该平台测序可以成功测序获得16S的全长序列。
6. 细胞器基因组测序
      叶绿体基因组和线粒体基因组序列都包含重复序列、反向重复序列等复杂结构,PacBio Sequel的长读长可直接跨越这些区域获得这些 细胞器的全基因组序列信息等,基因组组装不依赖于是否有近缘物种的线粒体和叶绿体基因组信息等、重测序能够检测到全面的SNPs 及inde信息。
7. 全基因组重测序&稀有变异鉴定
      PacBio RS II  长读长测序reads无GC偏好,能够全面获得基因组的遗传变异,包括SNPs的鉴定到CNV、SV结构变异等,可运用至人 类癌症基因组重测序等。PacBio Sequel平台10小时即可完成测序,可应用至需要快速反馈的临床检测中,如细菌感染疾病中细菌的鉴 定、病毒的鉴定等,取样开展重测序和目前已有的细菌、病毒基因组数据库进行比对鉴定即可。
8. 表观遗传学
     PacBio Sequel利用测序过程聚合酶反应的动力学变化,首次实现对碱基修饰进行直接测序。当碱基有额外修饰时,DNA聚合酶的合成 速度会减慢,对应的信号会被检测出来。每种碱基修饰事件都会使聚合酶的“停顿模式”PacBio Sequel产生微小差异,最终反映到荧 光脉冲信号的间隔上。除了甲基化修饰,还可以检测5-hC、5-hmU、5-hU、1-mA、6-mA、8-oxoA、BPDE、6-mT、6-mG等碱基 修饰,甚至可以鉴别传统亚硫酸氢盐测序法无法区分的甲基化修饰和羟甲基化修饰。PacBio Sequel平台可以在测序的同时即可检测表 观遗传学修饰信息,只需对测序数据选择合适的软件即可分析碱基修饰信息。

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