16S rDNA测序

    16S rDNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列,存在于所有细菌的基因组中。该基因序列足够长(包含约50个功能域)且具有高度的保守性和特异性。16s rDNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。随着数据库的不断完善,应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测。然而,受二代测序的读长限制,目前的微生物多样性研究仅检测16S rDNA的某几段高变区,物种分类也只能精确到“属”的水平。

     天津生物芯片利用PacBio RSii三代测序平台,可以无需PCR扩增,实现完全意义上的单分子扩增测序。16s作为鉴定物种分类的“分子钟”基因,目前采用二代测序虽然可以测其保守区,但区分度一直受测序长度影响。而三代平台的PacBio RS II的平均读长为10-14Kb,16S rDNA长度大约为1500bp左右,因此结合该平台测序可以成功测序获得16S的全长序列,这样在微生物鉴定方面注释信息可靠度会更为精确。

测序策略

测序原理

首先,Adaptor(SMRTbells)加到扩增子的两端。

然后测序引物与SMRTbells退火。紧接着DNA聚合酶结合到复合体上。

随后聚合酶-扩增子-adaptor组成的复合体被固定到ZMWs中进行复制,产生核苷酸特异性的荧光信号。CCS使得聚合酶对环形链进行扩增,产生具有随机错误的长读长序列。

运行结束后,去除接头(SMRTbell),单分子末端补齐,产生一条序列,CCS测序结果的单分子覆盖度和准确度取决于扩增子和序列长度,扩增子越小,读取长度越长,单分子覆盖度和准确度就越高。

产品优势

高通量:能同时分析群落中所有的微生物 高数据质量;

采用PacBio的CCS模式,对序列自我矫正,数据一致性准确率高 高分辨率;

分析16S rDNA全长,分类地位精确到“种” 无碱基偏好性,不受GC含量的影响 不需经过扩增,降低了仪器引起的测序错误率;

产品特点


Pacbio研究实例
  Mothur作者Patrick D Schloss在2015年最新的文章,详细讨论了16s不同区域/不同注释数据库/不同测序技术之间的比较。
以下是三代和二代,以及不同数据库/不同测序区域,对测序注释的影响比较:

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