PacBio RS II测序系统

第三代测序-单分子实时测序
 

一,  PacBio RS II 测序平台介绍

二,   PacBio RS II 测序系统服务领域
1
 动植物复杂基因组测序
2
 真菌基因组完成图
3
 细菌基因组完成图
4
 BAC克隆完成图
5
 从头组装(DE Novo Assembly6,甲基化检定

三, 天津生物芯片提供的Pacbio RS II系统测序方案

四,  PacBio RS II测序系统收样要求

五,  PacBio RS II 测序系统优势

六, PacBio RS II 测序系统原理 

七,Pacbio平台实际案例


 

 

一,PacBio RS II 测序平台介绍
PacBio RS测序仪系统是太平洋生物技术公司(Pacific Biosciences)基于单分子实时(SMRT)测序技术的第三代测序平台,可以在一天内完成从样品制备到测序和读取序列的全过程。天津生物芯片利用PacBio RS测序仪系统全面解决了二代测序几大困扰:海量数据拼接难,变异检测假阳性高,稀有突变被淹没,高GC含量区域无法跨越,高度片段无法准确测定等,得到高质量,完整的数据信息,为合作伙伴提供优质的基因组组装,目标区域测序,碱基修饰检测等技术服务。

二,PacBio RS II 测序系统服务领域
1, 动植物复杂基因组测序
(1)杂合基因组:杂合基因组主要指杂合率高于0.5%的二倍体基因组,如大部分水产类和昆虫等;
(2)高重复基因组:主要指重复序列比例高于50%的二倍体基因组,大部分林木;
(3)超大基因组:基因组大小大于3G,甚至是10G以上的物种,如两栖类,部分林木;
(4)多倍体基因组:如四倍体、六倍体植物等。

图1 主要技术策略示意图
2, 真菌基因组完成图
(1) 适用于所有真菌菌株;
(2) 尤其适合超高GC/超低GC真菌;
(3) 其它用传统方法测序比较困难真菌;
(4) 真菌基因组草图或精细图补洞。
3, 细菌基因组完成图
(1) 普通细菌快速完成图构建;
(2) 尤其适合超高GC/超低GC细菌;
(3) 其它用传统方法测序比较困难细菌菌株
通过采用第三代测序技术,直接进行细菌基因组的完成图绘制。

4, BAC克隆完成图
通过PacBio RS平台进行单分子实时测序,可以快速得到超长读长。再加大测序深度,PacBio序列可以产生非常均一覆盖度,在大部分目标区域内,可以接近100%的覆盖度。
这种方式对于有超高GC含量、超低碱基复杂度等BAC克隆非常具有优势。根据PacBio公司提供的Poster,由1Pacific Biosciences公司和University of Washington, Seattle对人类基因组一个约1.6Mb的片段,总共8个BAC克隆进行了PacBio测序,对比了Illmina测序,总体上得到了非常好的效果。(见下图)

5, 从头组装(DE Novo Assembly)
PacBio RS平台是目前唯一能完成完整基因组组装,结构测定和基因分型的微生物测序平台。该平台可以用PacBio数据独立完成微生物基因组的完整拼接,也可以将PacBio长读长数据和二代测序短读长数据进行混合拼接完成基因组。

      6,甲基化检定

     SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法。DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中。核苷酸的掺入被检测成荧光脉冲,依据其颜色鉴定出核苷酸。当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时,脉冲终止。荧光脉冲的到达时间和持续时间产生了关于聚合酶动力学的信息,从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸,包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。

    三,天津生物芯片提供的Pacbio RS II系统测序方案
PACBIO RS 系统可提供多种SMRT测序方案,如标准测序、环形比对测序、频闪测序,每种方法都利用了长片段读取的优势并结合SMRT bell模板形式(模板处理后形成的一个类似哑铃的结构)和单DNA 聚合酶原理。
1)标准测序:从插入片段的一端测到另一端,只测一次。适合插入片段在 1-6Kb间。主要应用于再测序和重头测序。
2)环形比对测序:从插入片段的一端测到另一端后,由于模板是哑铃状结构的,因此,继续测序将得到互补链的序列信息,从而可通过对插入片段的反复测序来获得高准确度的单分子测序结果。适合插入片段在 250-500bp。主要用于发现和确定稀有变异。
3)频闪测序:由于激光连续照射会对 DNA聚合酶活性造成一定影响,因此,可以通过将激光器按照一定间隔打开和关闭,获得相对标准测序来说更长时间的聚合酶活性。这样可获得一系列分散的读取序列从而增加对超长插入片段的物理覆盖率。适合长度高达 10K的插入片段。主要用于结构变异的鉴定或者对复杂重复区域的拼接。
在每一种测序方案中,用户都可以调整参数,适合多种应用和项目类型。这种灵活性也提供了分多个步骤解决一个问题的能力。
四, PacBio RS II测序系统收样要求

1, 未经强酸或强碱处理,未进行PCR扩增的高纯度全基因组DNA;
2, 基因组DNA不能有RNA或蛋白污染,电泳检测不能有弥散条带,要求提供电泳图结果;
3, 用于技术服务的基因组DNA的总量大于30微克;

五,PacBio RS II 测序系统优势
     采用PacBio RS 平台,进行单分子实时测序(single molecule, real-time SMRT)主要技术优势有:

     1、超长的测序读长:平均测序读长能达到3,000至5,000碱基,最长的序列能达到20,000碱基;

      2、极端的准确率:对基因组组装和基因组变异检测,可以最多达到99.999%的准确率;选用特殊测序模式,测序准确率可以在达到单个分子99%准确率的条件下,读长超过经典的Sanger测序法;

       3、极度的敏感性:可以检测频率在0.1%的 minor variants;

       4、直接检测广泛的碱基修饰:除了5-methylcytosine修饰以外, 还可以检测N6-methyladenine, N4-methylcytosine, DNA氧化损伤 以及其它碱基的修饰.

      5、最小的GC偏向性(GC bias):在极端高GC和极端低GC区域,可以轻松测定,从而保证序列的均匀覆盖度;

      6、无PCR扩增偏向性:样本不需要进行PCR扩增,避免了覆盖度不均一和PCR artifacts.
六,PacBio RS II 测序系统原理
      PacBio RS测序仪系统的关键优势是能够对单个DNA(脱氧核糖核酸)分子进行测序,而目前市场上的主流测序仪只能对分子群体进行平均测序。单分子测序能对DNA中罕见的序列变异进行分析,也不需要在测序之前对DNA样本进行放大,因为放大过程可能引发错误,导致对某个DNA序列检测失败。其工作原理是用一种聚合酶将DNA的复制限制在一个微小的间隙中,给各种碱基加上荧光示踪标记,当碱基合成DNA链时,这些荧光标记就会发出不同颜色的闪光,根据闪光颜色就可识别出不同的碱基。  

 七,Pacbio平台实际案例
利用PacBio平台,我们针对分离自土壤的GC含量的高达70%的细菌进行了基因组完成图测序,仅进行用了2个cell的测序,获得超过900Mb的测序数据,实现该菌基因组100X以上测序覆盖。通过PacBio数据De novo拼接获得该菌的基因组完成图序列;随后我们利用Illumina平台进行了位点校正,最终获得高准确性的基因组完成图。

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